Набор праймеров для детекции энтерококковых бактериофагов

Актуальность. Разработка и применение терапевтических препаратов на основе вирусов бактерий, или бактериофагов, является перспективным направлением борьбы с бактериальными инфекциями. Состав фаговых препаратов должен постоянно обновляться, что требует поиска новых вирусов посредством скрининга биологического материала и образцов из окружающей среды.

Цель. Разработка метода поиска и идентификации вирулентных энтерококковых бактериофагов, основанного на полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Материалы и методы. Известное разнообразие вирусов энтерококков было изучено по базам данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) и Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV). Подбор праймеров осуществляли при помощи программ NCBI PrimerBlast и Primer3. Тестирование праймеров проводилось на семи коммерческих фаговых коктейлях и 46 образцах биоматериала. Специфичность ПЦР была подтверждена определением нуклеотидных последовательностей ПЦР-продуктов.

Результаты. Описанные в литературе облигатно вирулентные энтерококковые бактериофаги относятся к пяти утвержденным ICTV родам: Copernicusvirus, Efquatrovirus, Kochikohdavirus, Saphexavirus и Schiekvirus. Представители шестого рода, Phifelvirus, обладают умеренным жизненным циклом. Разработанная нами схема ПЦР предназначена для специфичной амплификации фрагментов гена основного белка капсида упомянутых родов бактериофагов. В коммерческих фаговых коктейлях с ее помощью были выявлены представители всех пяти родов вирулентных энтерококковых бактериофагов. В образцах биологического материала были выявлены вирусы — представители родов Efquatrovirus, Kochikohdavirus, Saphexavirus и Sсhiekvirus.

Заключение. Представленная в настоящей работе схема ПЦР позволяет выявлять в фаголизатах и образцах биологического материала все описанные к настоящему времени облигатно вирулентные бактериофаги, инфицирующие Enterococcus spp., а также может быть использована для определения родовой принадлежности вирусов.

1. Fiore E, Van Tyne D, Gilmore MS. Pathogenicity of enterococci. Microbiology spectrum. 2019;7(4):10.1128/ microbiolspec.GPP3-0053-2018. DOI: 10.1128/microbiolspec.GPP3-0053-2018.

2. Gordillo Altamirano FL, Barr JJ. Phage therapy in the postantibiotic era. Clin Microbiol Rev. 2019;32(2):e00066-18. DOI: 10.1128/CMR.00066-18.

3. Pirnay JP, Blasdel BG, Bretaudeau L, Buckling A, Chanishvili N, Clark JR, Corte-Real S, Debarbieux L, Dublanchet A, De Vos D, et al. Quality and safety requirements for sustainable phage therapy products. Pharm Res. 2015;32(7):2173–9. DOI: 10.1007/s11095014-1617-7.

4. Sboner A, Mu XJ, Greenbaum D, Auerbach RK, Gerstein MB. The real cost of sequencing: higher than you think! Genome Biol. 2011;12(8):125. DOI: 10.1186/gb2011-12-8-125.

5. Duda RL, Teschke CM. The amazing HK97 fold: versatile results of modest differences. Curr Opin Virol. 2019;36:9–16. DOI: 10.1016/j.coviro.2019.02.001.

6. Koonin EV, Dolja VV, Krupovic M, Varsani A, Wolf YI, Yutin N, Zerbini FM, Kuhn JH. Global organization and proposed megataxonomy of the virus world. Microbiol Mol Biol Rev. 2020;84(2):e00061-19. DOI: 10.1128/MMBR.00061-19.

7. Tkachev PV, Pchelin IM, Azarov DV, Gorshkov AN, Shamova OV, Dmitriev AV, Goncharov AE. Two novel lytic bacteriophages infecting Enterococcus spp. are promising candidates for targeted antibacterial therapy. Viruses. 2022;14(4):831. DOI: 10.3390/v14040831.

8. McCallin S, Sarker SA, Sultana S, Oechslin F, Brüssow H. Metagenome analysis of Russian and Georgian Pyophage cocktails and a placebo-controlled safety trial of single phage versus phage cocktail in healthy Staphylococcus aureus carriers. Environ Microbiol. 2018;20(9):3278–3293. DOI: 10.1111/14622920.14310.

9. Алешкин А.В., Селькова Е.П., Ершова О.Н., Савин И.А., Шкода А.С., Бочкарева С.С., Митрохин С.Д., Киселева И.А., Орлова О.Е., Рубальский Е.О., Зулькарнеев Э.Р. Концепция персонализированной фаготерапии пациентов отделения реанимации и интенсивной терапии, страдающих инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи. Фундаментальная и клиническая медицина. 2018;3(2):66–74.

10. Schleifer KH, Kilpper-Bälz R. Transfer of Streptococcus faecalis and Streptococcus faecium to the genus Enterococcus nom. rev. as Enterococcus faecalis comb. nov. and Enterococcus faecium comb. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 1984;34(1):31–4.

11. Turner D, Kropinski AM, Adriaenssens EM. A roadmap for genome-based phage taxonomy. Viruses. 2021;13(3):506. DOI: 10.3390/v13030506.

12. Duan Y, Llorente C, Lang S, Brandl K, Chu H, Jiang L, White RC, Clarke TH, Nguyen K, Torralba M, et al. Bacteriophage targeting of gut bacterium attenuates alcoholic liver disease. Nature. 2019;575(7783):505–511. DOI: 10.1038/s41586-019-1742-x.

13. Barylski J, Kropinski AM, Alikhan NF, Adriaenssens EM, Ictv Report Consortium. ICTV Virus Taxonomy Profile: Herelleviridae. J Gen Virol. 2020;101(4):362–363. DOI: 10.1099/jgv.0.001392.

14. Khalifa L, Brosh Y, Gelman D, CoppenhagenGlazer S, Beyth S, Poradosu-Cohen R, Que YA, Beyth N, Hazan R. Targeting Enterococcus faecalis biofilms with phage therapy. Appl Environ Microbiol. 2015;81(8):2696–705. DOI: 10.1128/AEM.00096-15.

15. Miller ES, Kutter E, Mosig G, Arisaka F, Kunisawa T, Rüger W. Bacteriophage T4 genome. Microbiol Mol Biol Rev. 2003;67(1):86–156. DOI: 10.1128/MMBR.67.1.86156.2003.

16. Takeuchi I, Osada K, Azam AH, Asakawa H, Miyanaga K, Tanji Y. The presence of two receptorbinding proteins contributes to the wide host range of staphylococcal Twort-like phages. Appl Environ Microbiol. 2016;82(19):5763–74. DOI: 10.1128/AEM.01385-16.

17. Korf IHE, Meier-Kolthoff JP, Adriaenssens EM, Kropinski AM, Nimtz M, Rohde M, van Raaij MJ, Wittmann J. Still something to discover: novel insights into Escherichia coli phage diversity and taxonomy. Viruses. 2019;11(5):454. DOI: 10.3390/v11050454.

18. Sozhamannan S, McKinstry M, Lentz SM, Jalasvuori M, McAfee F, Smith A, Dabbs J, Ackermann HW, Bamford JK, Mateczun A, et al. Molecular characterization of a variant of Bacillus anthracisspecific phage AP50 with improved bacteriolytic activity. Appl Environ Microbiol. 2008;74(21):6792–6. DOI: 10.1128/AEM.01124-08.

19. Hyman P, Abedon ST. Smaller fleas: viruses of microorganisms. Scientifica (Cairo). 2012;2012:734023. DOI: 10.6064/2012/734023.