Редактирование генома с использованием SAM-системы для получения изогенных клеточных линий с оверэкспрессией белка CD5 человека

Проведение экспериментов in vitro и in vivo зачастую требует создания удобного клеточного инструментария, позволяющего надежно контролировать специфичность тестируемых соединений или подходов в отношении белка-мишени. Идеальным решением таких задач является использование клеточных линий, отличающихся по наличию или отсутствию единственного интересующего целевого белка. Клонирование и эффективная доставка кассет, кодирующих такие белки, особенно крупные, как правило, сопряжены с рядом трудностей, равно как и нокаутирование кодирующих их генов. В работе представлен универсальный подход для преодоления данной проблемы с использованием SAM (Synergistic Activation Mediator)-технологии, основанной на элементах системы CRISPR/Cas9, в результате применения которого было получено четыре модельных изогенных клеточных линии человека (U343, HeLa, HT-1080 и HEp-2) с оверэкспрессией белка CD5.

1. Kumar M, Keller B, Makalou N, Sutton R. Systematic Determination of the Packaging Limit of Lentiviral Vectors. Human Gene Therapy. 2001; 12: 1893–1905.

2. Pezzoli D, Giupponi E, Mantovani D, Candiani G. Size matters for in vitro gene delivery: Investigating the relationships among complexation protocol, transfection medium, size and sedimentation. Scientific Reports. 2017; 7: 44134.

3. Cong L, Ran F, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu P, Wu X, Jiang W, Marraffini L, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science (New York, N.Y.). 2013; 339(6121): 819-–823.

4. Dominguez A, Lim W, Qi L. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2015; 17(1): 5–15.

5. Konermann S, Brigham M, Trevino A, Joung J, Abudayyeh O, Bárcena C, Hsu P, Habib N, Gootenberg J, Nishimasu H, Nureki O, Zhang F. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPRCas9 complex. Nature. 2014; 517(7536): 583–588.

6. Joung J, Konermann S, Gootenberg J, Abudayyeh O, Platt R, Brigham M, Sanjana N, Zhang F. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 2017; 12: 828–863.

7. Scherer L, Brenner M, Mamonkin M. Chimeric Antigen Receptors for T-Cell Malignancies. Frontiers in Oncology. 2019; 9: 126.

8. Moiseeva E, Leyland M, Bradding P. CADM1 is expressed as multiple alternatively spliced functional and dysfunctional isoforms in human mast cells. Molecular Immunology. 2012; 53: 345–354.

9. Bernard A, Boidot R, Vegran F. Alternative Splicing in Cancer and Immune Cells. Cancers. 2022; 14(7): 1726.

10. Nuñez J, Chen J, Pommier G, Cogan J, Replogle J, Adriaens C, Ramadoss G, Shi Q, Hung K, Samelson A, Pogson A, Kim J, Chung A, Leonetti M, Chang H, Kampmann M, Bernstein B, Hovestadt V, Gilbert L, Weissman J. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 2021; 184(9): 2503–2519.

11. Hilton I, D’Ippolito A, Vockley C, Thakore P, Crawford G, Reddy T, Gersbach C. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nature Biotechnology. 2015; 33(5): 510–517.

12. Klann T, Black J, Chellappan M, Safi A, Song L, Hilton I, Crawford G, Reddy T, Gersbach C. CRISPR-Cas9 epigenome editing enables high-throughput screening for functional regulatory elements in the human genome. Nature Biotechnology. 2017; 35(6): 561–568.