МЕТОДОЛОГИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЕДИНИЧНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ РАЗЛИЧНОГО КЛЕТОЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Внеклеточные везикулы — это гетерогенная группа частиц, окруженных фосфолипидным бислоем и имеющих диаметр от 30 нм до 5 мкм. В последние годы активно изучается участие внеклеточных везикул в патогенезе многих заболеваний, а также возможности их применения в диагностике и терапии. Известно, что везикулы могут переносить нуклеиновые кислоты, в частности микро-РНК, мРНК и т.д., чем зачастую обусловлено их участие в регуляции многих патологических и физиологических процессов в организме, а также в межклеточной кооперации. Репертуар переносимых везикулами микро-РНК может значительно меняться в зависимости от их клеточного происхождения и функционального состояния клеток. Для изучения роли переносимых внеклеточными везикулами микро-РНК необходимы разработка и валидация новых подходов по целевому получению этих объектов с последующим изучением переносимого ими груза. Целью данного исследования являлось определение возможности использования метода высокочувствительного флуоресцентно-активированного сортинга для получения единичных внеклеточных везикул с заданным фенотипом из образцов плазмы крови. Из образцов плазмы крови здоровых доноров методом высокочувствительного флуоресцентно-активированного сортинга получали стандартное количество везикул тромбоцитарного и эритроцитарного происхождения с фенотипом CD41+CD235a- и CD41- CD235a+, соответственно, с ранжированием от 1 до 15 625 шт. в пробе. Методом количественной ПЦР оценивали уровень miR-451a, miR-199a-3p, miR-21-5p во всех образцах отсортированных везикул. Полученные результаты свидетельствуют о том, что для определения уровня микро-РНК во внеклеточных везикулах, независимо от их клеточного происхождения, количество частиц в образце должно быть более 3125. При этом, учитывая высокую вариабельность количества конкретных микро-РНК в зависимости от клеточного происхождения везикул, целесообразно уточнять целевой порог внеклеточных везикул при проведении каждого отдельного эксперимента.

1. Harrison P, Gardiner C, Sargent IL. Extracellular vesicles.

2. Willms E, Johansson HJ, Mäger I, et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep; 6. Epub ahead of print 2 March 2016. DOI:10.1038/SREP22519.

3. Teng F, Fussenegger M. Shedding Light on Extracellular Vesicle Biogenesis and Bioengineering. Adv Sci 2021; 8: 2003505.

4. Théry C, Witwer KW, Aikawa E, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell vesicles; 7. Epub ahead of print 1 January 2018. DOI:10.1080/20013078.2018.1535750.

5. Gurunathan S, Kang MH, Qasim M, et al. Biogenesis, Membrane Trafficking, Functions, nd Next Generation Nanotherapeutics Medicine of Extracellular Vesicles. Int J Nanomedicine 2021; 16: 3357.

6. Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science; 367. Epub ahead of print 7 February 2020. DOI:10.1126/SCIENCE.AAU6977.

7. Battistelli M, Falcieri E. Apoptotic Bodies: Particular Extracellular Vesicles Involved in Intercellular Communication. Biology (Basel); 9. Epub ahead of print 1 January 2020. DOI:10.3390/BIOLOGY9010021.

8. Niel G Van, Angelo GD, Raposo G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Publ Gr. Epub ahead of print 2018. DOI:10.1038/nrm.2017.125.

9. Mathieu M, Martin-Jaular L, Lavieu G, et al. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nat Cell Biol 2019; 21: 9–17.

10. Simeone P, Bologna G, Lanuti P, et al. Extracellular Vesicles as Signaling Mediators and Disease Biomarkers across Biological Barriers. Int J Mol Sci; 21. Epub ahead of print 1 April 2020. DOI:10.3390/IJMS21072514.

11. Abhange K, Makler A, Wen Y, et al. Small extracellular vesicles in cancer. Bioact Mater 2021; 6: 3705.

12. Yang S, Che SPY, Kurywchak P, et al. Detection of mutant KRAS and TP53 DNA in circulating exosomes from healthy individuals and patients with pancreatic cancer. Cancer Biol Ther 2017; 18: 158.

13. Hill AF. Extracellular Vesicles and Neurodegenerative Diseases. J Neurosci 2019; 39: 9269.

14. Asai H, Ikezu S, Tsunoda S, et al. Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation. Nat Neurosci 2015; 18: 1584.

15. Cooper JM, Wiklander PBO, Nordin JZ, et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alphasynuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov Disord 2014; 29: 1476.

16. Guay C, Regazzi R. Exosomes as new players in metabolic organ cross-talk. Diabetes Obes Metab 2017; 19 Suppl 1: 137–146.

17. Zhang Y, Hu YW, Zheng L, et al. Characteristics and Roles of Exosomes in Cardiovascular Disease. https://home.liebertpub.com/dna 2017; 36: 202–211.

18. Jadli AS, Parasor A, Gomes KP, et al. Exosomes in Cardiovascular Diseases: Pathological Potential of Nano-Messenger. Front Cardiovasc Med 2021; 0: 1483.

19. Rautou PE, Leroyer AS, Ramkhelawon B, et al. Microparticles from human atherosclerotic plaques promote endothelial ICAM-1-dependent monocyte adhesion and transendothelial migration. Circ Res 2011; 108: 335–343.

20. Yuan Y, Du W, Liu J, et al. Stem Cell-Derived Exosome in Cardiovascular Diseases: Macro Roles of Micro Particles. Front Pharmacol 2018; 9: 547.

21. Johnsen KB, Gudbergsson JM, Andresen TL, et al. What is the blood concentration of extracellular vesicles? Implications for the use of extracellular vesicles as blood-borne biomarkers of cancer. Biochim Biophys Acta - Rev Cancer 2019; 1871: 109–116.

22. Liangsupree T, Multia E, Riekkola ML. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. J Chromatogr A 2021; 1636: 461773.

23. Kormelink TG, Arkesteijn GJA, Nauwelaers FA, et al. Prerequisites for the analysis and sorting of extracellular vesicle subpopulations by high-resolution flow cytometry. Cytometry A 2016; 89: 135–147.

24. Higginbotham JN, Zhang Q, Jeppesen DK, et al. Identification and characterization of EGF receptor in individual exosomes by fluorescence-activated vesicle sorting. J Extracell Vesicles; 5. Epub ahead of print 2016. DOI:10.3402/jev.v5.29254.

25. Cao Z, Li C, Higginbotham JN, et al. Use of Fluorescence-activated Vesicle Sorting for Isolation of Naked2-associated, Basolaterally Targeted Exocytic Vesicles for Proteomics Analysis. Mol Cell Proteomics 2008; 7: 1651.

26. Atkin-Smith GK, Paone S, Zanker DJ, et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Sci Reports 2017 71 2017; 7: 1–7.

27. Pieragostino D, Lanuti P, Cicalini I, et al. Proteomics characterization of extracellular vesicles sorted by flow cytometry reveals a disease-specific molecular cross-talk from cerebrospinal fluid and tears in multiple sclerosis. J Proteomics; 204. Epub ahead of print 30 July 2019. DOI:10.1016/J.JPROT.2019.103403.

28. Tkach M, Kowal J, Théry C. Why the need and how to approach the functional diversity of extracellular vesicles. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci; 373. Epub ahead of print 5 January 2018. DOI:10.1098/RSTB.2016.0479.

29. Ferguson SW, Nguyen J. Exosomes as therapeutics: The implications of molecular composition and exosomal heterogeneity. J Control Release 2016; 228: 179–190.

30. Zhang J, Li S, Li L, et al. Exosome and Exosomal MicroRNA: Trafficking, Sorting, and Function. Genomics Proteomics Bioinformatics 2015; 13: 17.

31. Fabbri M, Paone A, Calore F, et al. MicroRNAs bind to Toll-like receptors to induce prometastatic inflammatory response. Proc Natl Acad Sci U S A 2012; 109: E2110.

32. Veziroglu EM, Mias GI. Characterizing Extracellular Vesicles and Their Diverse RNA Contents. Front Genet; 11. Epub ahead of print 17 July 2020. DOI:10.3389/FGENE.2020.00700.

33. Murillo OD, Thistlethwaite W, Rozowsky J, et al. ExRNA Atlas Analysis Reveals Distinct Extracellular RNA Cargo Types and Their Carriers Present Across Human Biofluids. Cell 2019; 177: 463.

34. Liu T, Zhang Q, Zhang J, et al. EVmiRNA: a database of miRNA profiling in extracellular vesicles. Nucleic Acids Res 2019; 47: D89.

35. Kondratov K, Nikitin Y, Fedorov A, et al. Heterogeneity of the nucleic acid repertoire of plasma extracellular vesicles demonstrated using high-sensitivity fluorescence-activated sorting. J Extracell Vesicles; 9. Epub ahead of print 2020. DOI:10.1080/20013078.2020.1743139.